荧光分析和成像技术因具有非常高的灵敏度和分子特异性而广泛的应用于生物物理、生物化学、医学、物理、化学等领域，利用荧光光谱技术和荧光显微技术可以分析样品中荧光团的组分和分布。不过，由于荧光分析技术大多是基于荧光强度的测量，容易受到激发光强度、样品浓度淬灭、荧光染料的分布浓度等因素的影响，因此，其很难对样品做定量测量。

荧光寿命通常来讲是绝对的，不受激发光强度、荧光团浓度等因素的影响，仅仅与荧光团所处的微环境有关，因此，利用荧光寿命显微镜（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）对样品进行荧光寿命成像，可以对样品所在的微环境中的许多物理参数如氧压、溶液疏水性等及生物化学参数如pH值、离子浓度等进行定量测量[1, 2]。此外，荧光寿命成像技术还可以同时获得分子状态和空间分布的信息。

荧光是分子吸收能量后，基态电子被激发到单线激发态后从第一单线激发态回到基态时所产生的，而荧光寿命是指分子在单线激发态平均停留的时间。分子吸收光后去激活的过程如下图1 Perrin-Jablonski能级示意图所示。分子中处于单线态的基态电子能级S0上的电子，根据Frank-Condon规则吸收某一波长的光子后，被激发到单线态的激发态电子能级S1中的某一个振动能级上，这个过程的时间约为10^-15 s；经过短暂的振动驰豫过程后（时间约10^-12~10^-10 s），S1态的最低振动能级上会积累大量的电子。这一状态的电子有几种释放能量，回到基态S0能级的途径，包括振动驰豫在内的这些途径被统称为去活化的过程。如果能量释放的过程中，伴随有光子的产生，那么称这种方式为辐射去活；如果通过碰撞等途径释放能量，没有光子的产生，那么称这种方式为无辐射去活。
 

图1 Perrin-Jablonski能级示意图

荧光发射是一种较为常见的辐射去活过程，其通常指电子从S1态向S0态的跃迁，且同时向外产生光子的过程，这个过程的时间通常在10^-10~10^-7 s。利用光学仪器检测荧光发射的强度随时间的变化，就可以得到体系的荧光信息。
无辐射去活过程有如下几种途径：
1、内转换
内转换指的是电子在具有相同多重度的电子能级之间发生跃迁的过程，时间通常在10^-11到10^-9。
2、系间跨越
 系间跨越指电子在不同多重度的能级间发生跃迁的过程，比如单线态S1向三线态T1的跃迁，时间通常在10^-10~10^-8。
3、荧光淬灭
 荧光淬灭是指激发分子通过分子间的相互作用和能量转换而释放能量的过程，也称作外转换。

以上无辐射去活过程在决定体系的荧光寿命时起到非常重要的作用。此外，电子跃迁到T1态后，也会有一定几率以释放光子的形式跃迁至S0态，这称作磷光发射；或者再次系间跨越回S1态，并释放一个光子后回到S0态，这称作延迟荧光。

 

荧光寿命
在激发光源的照射下，一个荧光体系向各个方向发出荧光，当光源停止照射后，荧光不会立即消失，而是会逐渐衰减到零。荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回到基态之前，在激发态的平均停留时间。处于激发态的荧光分子在退激发到基态的过程中发射荧光释放能量，激发态荧光团荧光强度的衰减用数学式可表达为单指数函数[3]:

         （1）

其中，I(t)是样品受到光脉冲激发后t时刻测量到的强度；I0是t=0时的强度；τ是平均荧光寿命且为分子的特征值，定义为荧光强度衰减到初始值I0的1/e（37%）时所需要的时间。实际上，由于荧光的发射是一个统计的过程，很少有荧光分子恰好在τ（荧光寿命）时刻发射荧光，因此，荧光寿命仅反映荧光强度衰减到其起始值1/e所需要的时间。此外，用仪器观察到的荧光寿命τ与激发态S1的寿命等价，不仅会受到荧光发射速率的影响，还会受到各种非辐射过程的影响，因此，用仪器直接测量到的表观荧光寿命也称作自然寿命。
对于复杂的荧光体系，由于各种荧光物质的性质或所处微观环境的不同，整个体系的荧光衰减曲线是多个指数衰减函数的加和，这称为多指数衰减：

       （2）

荧光寿命的测量方法主要有时域法和频域法[4]。时域法也叫作脉冲法，用超短光脉冲激发样品，测量样品在受到光脉冲激发后荧光强度的衰减规律如公式1，然后根据测量到的样品中各点的荧光强度衰减曲线进行拟合分析并计算荧光寿命值。比较简单的一种情况是单组分的荧光寿命测量，这时只需要在样品受到超短光脉冲激发后，在两个不同的时刻分别测量荧光强度的衰减，然后再利用如下的公式计算样品的荧光寿命。

         （3）

其中，I1和I2分别是样品在受到超短光脉冲激发后，在t1和t2时刻分别测量到的荧光强度。

下图图2是时域法荧光寿命测量的示意图。时域法荧光寿命的测量和荧光寿命成像主要有时间相关单光子计数法（time correlated single photon counting, TCSPC）、门控探测法（time-gated detection）、条纹相机测量法（streak-FLIM）、频闪技术等四种常见的方法。下面将分别简要介绍各测量技术的工作原理。

图2 时域法荧光寿命测量示意图

时间相关单光子计数法（TCSPC）[5,6]
TCSPC是目前测量荧光寿命的主要技术，最早在1975年由PTI（Photon Technology International）公司首先商品化。TCSPC的工作原理如下图图3所示。同轴脉冲光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1启动时幅转换器（time-amplitude converter，TAC），时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。此外，同轴脉冲光源发出的脉冲光通过激发单色器后到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2到达时幅转换器并使其停止工作。此时，时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多通道分析仪（multi-channel analyzer）的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。经过几十万次的重复后，不同的时间通道累积下来的光子数目不相同。以光子数对时间做图可以得到如下图图4所示的直方图，然后经过拟合和平滑处理后得到荧光衰减曲线。

图3 TCSPC测量荧光寿命的工作原理图

图4 TCSPC荧光衰减曲线形成的示意图

在使用TCSPC测量荧光寿命的过程中，需要调节样品的荧光强度，确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电倍增管。TCSPC方法的突出优点是灵敏度高、测量结果准确、系统误差小。采用该技术对样品进行荧光寿命成像时，必须逐点测量样品的荧光寿命，而每一点的测量时间又比较长，因此，通常认为该技术不太适合荧光寿命测量。不过，近年来，随着TCSPC技术和固体超快激光技术的发展，TCSPC技术已具备快速测量荧光寿命的条件。通过与激光共聚焦显微镜的结合，可以对样品进行荧光寿命成像的测量。

门控探测法（time-gated detection）
门控探测法适用于单组分荧光强度衰减的测量和荧光寿命成像。荧光寿命可通过在两个不同延迟时刻开启的相同宽度的门内记录的荧光强度信息求得，如下图图5所示。通常情形下，在条件允许的情况下，采用多门控探测，即选取多个窗口获取多幅图像（通常为5~10幅）来反演寿命图像[7]。一般使用门控微通道板像增强器（MCP Intensifier）或者增强型CCD（Intensified CCD）相机，实现样品的宽场（full-field）荧光寿命成像。通过在样品受到超短光脉冲激发后的不同时刻（时间窗口）选通像增强器或CCD相机，获得一组荧光强度图像，然后利用公式（2）或者（1），逐点计算出样品上各点的荧光寿命并成像。

图5 门控探测法计算荧光寿命的示意图

门控探测法的光子使用率和时间分辨率受到探测器性能如脉冲响应特性的限制，另外，由于这种宽场成像方式一般是单光子激发，因此无法消除散射光和背景荧光的影响，成像的对比度和信噪比很低。不过，该实验装置实现简单，成像速度快。

典型的门控荧光寿命成像系统如下图图6所示。

图6 典型门控荧光寿命成像系统组成图

荧光寿命成像装置通常由激发光源、光电探测器、延迟仪器及图像处理设备组成。门控仪器的光源通常为短脉冲的超快激光器，常见的成像设备是CCD，延迟仪器提供FLIM的控制信号[8]。由于光电探测器和CCD等器件输出的是光强度信息，荧光寿命图像可以通过Rapid Lifetime Determination （RLD）和Weighted Nonlinear Least Square （WNLLS）[9]两种处理方法利用荧光强度图像通过反演得出。

条纹相机测量法（streak-FLIM）
条纹相机是一种具有非常高时间分辨率（<20 ps）和灵敏度的探测器，可以获得一维空间或光谱的时间分辨信息[10]。简言之，通过合适的柱面镜将激发光聚焦到样品上，利用光学系统将样品上一维空间信息成像到条纹相机的狭缝上，当扫描相机工作于动态扫描模式时，在荧光屏上就可以得到样品上一维空间的扫描图像（x, t）。依次沿扫描方向移动样品，就可得到样品的两维空间上的荧光衰减曲线。
下图图7是使用高重复频率条纹扫描相机的双光子激发荧光寿命成像系统框图[11]。

图7 使用条纹相机的双光子激发荧光寿命显微成像系统框图

该系统主要有钛宝石飞秒激光器、荧光显微镜、样品台、皮秒扫描相机、CCD系统及计算机组成。钛宝石飞秒激光器发出76MHz重复频率，120fs脉冲宽度的超短激光脉冲，工作波长可在700-980 nm范围内连续调谐。脉冲提取器（pulse picker）可把飞秒激光器输出的超短脉冲激光的重复频率由76MHz降为5MHz以下，脉冲提取器的重复频率设置为1MHz。该1MHz的激光脉冲使用30/70分光镜BS分成两束：主光束和触发光束。触发光束用来触发PIN，其产生的电脉冲通过可调节延迟器和脉冲放大器A后作为条纹相机的触发信号触发扫描电路，扫描电路产生的斜坡电压脉冲加到变像管的偏转板上形成瞬态的偏转电场，偏转电场作用于通过的电子束，实现线性扫描，从而将变像管荧光屏上对应的空间轴变为时间轴。主光束通过显微物镜后激发样品，并通过双光子效应使样品发出荧光，荧光通过显微物镜收集后，再经过一个大口径中继透镜L成像到皮秒条纹相机上。条纹相机上得到的图像通过后续光锥耦合的CCD实时读出系统转变为电信号，由此就能得到荧光强度随时间的衰减信号。对于条纹相机的详细工作原理，请查阅条纹相机的相关资料。

条纹相机可以提供非常高的时间分辨力，信号随时间连续变化的信息以及一维空间逐点随时间变化的信息。

下图图8是使用条纹相机的时间分辨荧光寿命系统测量到的罗丹明6G样品的荧光寿命图像（a）和荧光强度的衰减曲线（b）。

图8 使用条纹相机的时间分辨荧光寿命系统测量罗丹明6G样品的图像和衰减曲线

 

频闪技术[12]
频闪技术也叫脉冲取样技术（Pulse sampling techniques），1987年，PTI公司将实现了纳秒级频率荧光寿命测定仪的商品化。频闪技术的工作原理如下图图9（a）所示。实验测量过程中，脉冲光源发射出短脉冲激光，激发样品，同时向同步电压脉冲装置提供同步信号。同步电压脉冲启动或者按照一定的要求延迟启动光电倍增管，光电倍增管按照预设的时间门（△t）检测样品的荧光强度。通常检测时间门比荧光寿命短得多，这样通过逐渐改变光电倍增管的延迟时间，可以得到样品被脉冲光源激发后不同时刻的一系列荧光强度，如下图图9（b）所示。

图9 脉冲取样法测定荧光寿命的工作原理图

脉冲法的优势是与TCSPC有着相近的准确性，同时测量速度更快。劣势是脉冲法得到的荧光衰减曲线包含噪音的水平无法确切知道，故在数据分析时需要有所估计。

频域法测量
荧光寿命测量在频域法测量中的技术是调制技术[5]。调制技术是用强度按照正弦规律调制的激光激发样品，由于发射光是激发光的受迫响应，因此，发射光和激发光具有相同的角频率（ω），所以荧光发射的强度也是按照正弦调制的，而且两者的调制频率相同，不过，由于激发态的微小时间停滞——荧光寿命，调制后的发射波在相位上滞后激发波一个相位角φ。此外，相对于激发波，由于发射波也被部分解调，因此，其振幅比激发波的振幅要小，如下图图10所示。

图10 调制技术的示意图

实验上，通过测量荧光相对于激发光的相位差φ及解调系数M（发射波振幅与激发波振幅之比），然后通过计算公式便可计算出来相寿命（）和调制荧光寿命（）。
下图图11是频域法荧光寿命测量的原理图。

图11 频域法荧光寿命的测量原理图

假设荧光相对于激发光的相移为φ，调制系数为M，那么荧光寿命的计算公式为

                 （3）

其中，ω为调制角频率，φ为荧光相对于激发光的相位延迟，τ是荧光寿命。

            （4）

其中，是激发光的调制度，而 是荧光的调制度。对于单组分指数衰减，。当进行实验测量时，首先需要利用那些荧光寿命已知的样品或散射光对系统进行标定。
此外，从上述公式（3）和（4）来看，相移φ和调制度M都可以用来测量荧光寿命，只不过实际中，相位的测量比调制度的测量会更加精确，因此，测量荧光寿命通常采用测量相位差的方法[13]。对于不同的样品可以选择不同的调制频率（一般是荧光寿命的倒数），从而可扩大荧光寿命的测量范围。

调制技术依据激发光源、探测器、相位测量方法的不同可以分为单通道调制技术和调制像增强技术。
1、单通道调制技术
如下图图12所示，连续激光器发出的激光经调制到30MHz-1GHz后，激发样品产生的荧光用PMT或光电二极管探测，探测器信号的交流部分被放大输入到混频器，分别与0°和90°相移的调制信号混合。混频器输出的信号经过低通滤波器后可以计算出来相位差。在高频的时候，由于部分混频器不能良好的工作，在实验中，可以采用外差法降低输入到混频器的信号频率。图中混频器Mixer和后续的低通滤波器可以用锁相放大器如MFLI锁相放大器、HF2LI双通道锁相放大器、Moku:Lab锁相放大器和数字相位表等直接取代进行测量。

图12 单通道调制技术中信号测量的示意图

单通道调制技术对于光源的选择：
单光子激发——选择调制的激光二极管或者带有外部调制器的可调连续激光器
双光子激发——可以选择钛蓝宝石激光器
2、调制像增强器
调制像增强器与门控像增强器相似，采用真空设备探测信号，格栅被正弦波或方波信号驱动而不是门脉冲信号驱动。由于调制像增强器效率低，因此，不适合激光扫描显微方式荧光寿命而适用于宽场成像。

门控像增强器通过在光电阴极后面放置格栅，只要格栅电压相对于光电阴极是负的，光电子就不能通过格栅。只有当正脉冲到达时，电子才可以通过格栅网格并被加速到达微通道板，如下图图13所示。

图13 门控像增强器的结构示意图

 

标准门控像增强器有几个ns量级的最低门宽度，门控像增强器最短的门宽度是50ps，可用于低重复率的应用。

综上所述，荧光寿命成像（FLIM）有时域和频域测量法，时域测量中主要有TCSPC技术、门控探测技术、条纹相机探测技术和频闪技术；频域测量法中主要是调制技术。每一种测量技术在测量样品成像的过程中都有优势和劣势，在实际测量样品的荧光寿命时，需要根据实际的样品装填而综合考虑选择合适的荧光寿命测量技术。

 

参考论文
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[3] Andreas Schweitzer, Heinz Eipel, Christoph Cremer, Rapid image acquisition in multi-photon excitation fluorescence microscopy, Optik, 2004, 3: 115-120
[4] Christenson M, Stemberg S, Fluorescence lifetime imaging microscopy（FLIM） lets biologist study cellular processes, SPIE, 2004,1: 28-30
[5] Lakowicaz J R, Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd Edition, New York: Academic/Plenum Press, 1999: 95-136
[6] O’connor D V, Philips D, Time-correlated single photo counting, New York: Academic Press, 1984.
[7] R. Cubeddu R, D. Comelli, C. D’Andrea, et al, Time-resolved fluorescence imaging in biology and medicine, J. Physics D: Appl. Phys., 2002, 35(9): R61-R76
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[9] J. Requejo-Isidro, J. Mcginty, D. Elson, et al, High speed wide field time-gated endoscope fluorescence lifetime imaging, Opt. Lett., 2004, 29(19): 2249-2251
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[11] Lixin Liu, Junle Qu, Ziyang Lin, et al, A high repetition rate picosecond streak camera for two-photon excited fluorescence lifetime microscopic imaging, Acta Optica Sinica, 2006, 26(3):373-378
[12] Ware W R, James D R, Siemiarczuk A, Stroboscopic optical boxcar technique for the determination of fluorescence lifetimes, Rev. Sci. Instrum., 1992, 63: 1710-1716
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